实验动物染毒途径和技术

On 五月 13th, 2013, posted iin: 学术专栏 by     浏览次数:6,600 次

在毒理学试验中染毒途径的选择,应尽可能模拟人在接触该受试物的方式。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道;经皮及注射途径。染毒的途径和方法根据实验目的、实验动物种类和药物剂型等情况确定。不同途径的吸收速率,一般是静脉注射>吸入>肌内注射>腹腔注射>皮下注射>经口>皮内注射>其他途径(如经皮等)
    (一)经口(胃肠道)染毒

    常用有喂饲、灌胃和吞咽胶囊等方式。

    1.喂饲 将受试物掺人动物饲料或饮水中供实验动物自行摄人。如果受试物是完全无毒的,则在饲料中的最高含量可为5%,一些有营养价值的食物成分物质则可更高,但应注意不要造成饲料营养成分失衡而影响实验动物的生长发育。喂饲法符合人类接触受试物的实际情况,但缺点多,如适口性差的受试物,实验动物拒食;易挥发或易水解的受试物不适用。而且,实验动物应单笼喂饲,以食物消耗量计算其实际染毒剂量。
    2.灌胃 将受试物配制成溶液或混悬液,以注射器经导管注入胃内。一般灌胃深度从口至剑突下。最好是利用等容量灌胃法,即受试物配制成不同浓度,实验动物单位体重的灌胃容量相同。外源化学物用溶剂稀释,一般讲浓溶液比稀溶液毒性大,但是也有的外源化学物稀释之后毒性反而增加,即存在所谓“稀释毒性”,其原因尚不清楚。因此在发现有稀释毒性时等浓度灌胃法也可接受。灌胃前应禁食空腹,大鼠隔夜禁食,小鼠可禁食4h(因小鼠消化吸收和代谢速度较快),均不停饮水。灌胃后2—4h提供饲料。经口多次染毒,一般不禁食,但应每日定时染毒。灌胃法适用小鼠、大鼠、兔、犬等动物,优点是剂量准确,缺点是工作量大,并有伤及食管或误入气管的可能。

    (1)小鼠灌胃法;左手拇指和食指捏住小鼠头部两耳后皮肤,无名指或小指将尾部紧压在手上,使小鼠腹部向上。右手持灌胃管(1~2ml注射器上连接以14号注射针头,尖端磨钝,稍加弯曲的灌胃管),灌胃管长4~5cm,直径约lmm。操作时,经口角将灌胃管插人口腔,用胃管轻压小鼠头部,使口腔和食管成一直线,再将胃管沿上腭壁轻轻插入食管内,当推进约2~3cm左右时,灌胃管前端约到达膈肌水平(体重20g左右的小鼠),此时可稍感有抵抗。如此时动物无呼吸异常,即可将药注入。如遇阻力或动物憋气则应抽出重插管。如误插入气管注药时可引起动物立即死亡。药液注完后轻轻退出胃管。操作时宜轻柔,以防损伤食管及膈肌。
    (2)大鼠灌胃法:灌胃法与小鼠相似。采用的灌胃管长约6~8cra,直径约为1.2mm,尖端磨钝。插管时,为防止插人气管,应先抽回注射器针栓,无空气抽回说明不在气管内,即可注药。
 
    (3)犬和家兔灌胃法:由2人操作,将犬关人特制犬笼,并移动活动栅,挤犬并使之固定,持犬者两手握住犬耳后及颈部皮肤,使犬头部朝上颈部拉直。灌胃者用一木棍让犬咬住,将硬质胃管自木棍与上腭之间插入食管,约20cm左右即下达到胃腔(插入深度可预先在体外测量好,并做好记号);持兔者端坐两腿夹住兔躯干及其后肢,两手握住兔耳及前肢,将兔头朝上,使兔颈部拉直。灌胃者用开口器通过兔口角(在犬齿后)之空隙,将开口器向下转动数次,使兔舌伸出。开口器的孔应放置在口腔正中央,将硬质胃管通过开口器小孔插入食管,约10-15cm左右即下达到胃腔。如胃管进人胃内,动物较安静,无挣扎、气促等表现,应先抽回注射器针栓,无空气抽回说明不在气管内,即可用注射器推入药液,再推入2~3mi水,以送人留滞在胃管内的药液,灌胃完毕,迅速抽出胃管,然后取出木棍或开口器。
 
 
    3.吞咽胶囊 将一定剂量的受试物装入胶囊中,放至犬的舌后部,迫使动物咽下,此法剂量准确,适用于易挥发、易水解和有异味的受试物。
 
    (二)经呼吸道染毒

    经呼吸道染毒可分为吸入染毒和气管内注入。

    1.静式吸人染毒 将一定数量的啮齿类动物放在密闭的染毒柜中,加人易挥发的液态受试物或气态受试物使成一定浓度。静式吸入染毒简易,但缺点较多,主要是随试验进行氧分压降低(因此,实验动物数量有限制),柜内受试物浓度也逐渐下降(由于动物吸人消耗、为被毛及染毒柜壁吸附所致),而且实验动物有经皮吸收的可能。染毒时间一般为2h。要求受试物在lOmin内蒸发完毕。

    柜顶盖部有三个附件。一个是投药孔,在孔下方用多层纱布或滤纸作为接受和蒸发液态受试物的药物蒸发器;一个是用于混匀蒸气或气体的小电扇;一个是插人温度计的孔。在柜的下部的1/4处还留有一个供采样的孔。
静式吸人染毒时应根据染毒柜容积和染毒时间,确定放置的实验动物数,以保证动物的最低需气量(表1—4)。染毒柜所需容积也可按实验动物总体重(kg)×100×染毒时间h)来估算,相当于动物每kg体重每小时所需空气体积为100L。
 
 
    静式吸入染毒多以计算方法得到染毒柜内受试物浓度,受试物浓度以mg/m.易挥发液体化学物计算公式为
C=(a·d·l000)/L
 
    式中:C=设计的染毒浓度(mg亿);a=加入受试物的量(m1);L:染毒柜容积(L)。
 
    气态化学物加入为m1数,可依据染毒柜容积折算为ppm。单位mg/ml:
 
    记算公式为(式中MW为受试物的分子量):mg/m3=(MW·ppm)/22.4
 
     可在染毒期内测定受试物浓度2~3次,以其均值作为实际染毒浓度。
 
表1—4 实验动物的最低需气量及不同染毒柜容积应放置的动物数(染毒2h)
 
实验动物 呼吸量 最低呼吸量 静式染毒2h可放动物数
25L 50L 100L 300L 1000L
小鼠 1.45 4.50 3-5 6-10 12-15 36-40 120-150
大鼠 10.18 30.54 0 1 1-2 5-6 16-18
豚鼠 10.18 30.54 0 1 1-2 3-4 16-18
猫 19.30 57.90 0 0 0 3-4 9-10
家兔 41.5 126.80 0 0 0 1 4-5
猴 51.60 154.80 0 0 0 1 3-4
狗 321.60 97.80 0 0 0 0 1

 
    实验步骤:
 
    (1)将动物放人染毒柜(亦可连动物笼一起放人染毒柜)。
 
    (2)将染毒柜密闭好。
 
    (3)从投药孔将所需受试物加到药物蒸发器上,随即塞好投药孔井开始计算染毒时
 
 (4)观察实验动物的症状、死亡时间,并仔细记录。
 
   (5)染毒结束后,关闭电源,打开门(盖),驱出柜内残存有毒空气,取出动物,存活者归笼继续观察。
 
   (6)冲洗染毒柜,将动物排泄物冲干净,擦干染毒柜备用。
 
 
    2.动式吸入染毒 动式吸入染毒设备由染毒柜、机械通风系统和配气系统三部分构成对设备的要求较高,优点是在染毒过程中染毒柜内氧分压及受试物浓度较稳定,缺点是消耗受试物的量大,并易于污染环境。动式吸入染毒又分为整体接触和口鼻接触两种,此设备设计为维持每小时12~15次的换气,保证氧气浓度为19%受试物的均匀分布。染毒柜应维持成轻微的负压以免受试物从染毒柜逸出。要保证染毒柜中气流的稳定性,实验动物的总体积不能超过染毒柜容积的5%。如采用鼻—口或头部暴露吸入染毒法,可避免经口和皮肤同时接触受试物。应使用适当的浓度控制系统。应调整空气流速,以保证整个设备的条件一致。
 
 
    在染毒柜中受试物浓度达平衡后,每天的染毒时间应为6h。在必要时,也可利用其他的暴露时间。从实际考虑,每周染毒;天是可接受的。
 
 
    进行试验时温度应维持在(22±2)℃。相对湿度最好保持40%一60%之间(但不适用于气溶胶试验).染毒过程中,停止供食和供水。
 
 
    在进行下述的测量或监测时,应尽可能地使维持恒定:①气流速度,每次暴露应监测≥3次。②受试物的实际浓度和气溶胶浓度粒度分析,每次暴露测2—4次。③连续监测温度,每30min记录一次。
 
    3.气管内注入;此法用于建立急性中毒模型及尘肺研究。以大鼠为例,用乙醚轻度
 
 
    麻醉大鼠(侧卧即可),将麻醉的大鼠用线套住其门齿,挂在染尘架上,鼠背向操作者。用无齿镊夹住并拉出舌头,用小块纱布包裹舌头,用左手拉住。右手取耳镜放人大鼠口腔,暴露气管开口。使光线照射于耳镜,可见随呼吸时张时闭的v形白环(声带)。术者左手松开大鼠舌头并固定耳镜,右手接过助手传递的钝头穿刺针,待v形口张开时把针头插入气管约1-1.5cm,此时针头已达气管的上中段。助手将吸好注射液的注射器接在穿刺针上,回抽如有气泡,证明位于气管内,即可将受试液注入气管内。术前所有用具和受试液均应消毒,必要时可在受试液中加青霉素2000IU/ml。

 
(三)经皮肤染毒

    经皮肤染毒的目的有两种。一种是经皮染毒毒性试验,如经皮Lao测定常用大鼠,皮肤致癌试验常用小鼠‘另一种是皮肤刺激和致敏试验,皮肤刺激试验常用兔和豚鼠,皮肤致敏试验用豚鼠。

    被毛的去除:试验前用机械法(剪剃毛)或化学法(硫化胸或硫化钡)脱毛。对兔和啮6类常用的脱毛剂处方为:①硫化钠8e溶于l00ml水中;①硫化钠3份、洗衣粉l份、淀粉7份加水调成糊状,用脱毛剂前,先剪去脱毛部位的桩毛,注意不可用水浸被毛,以防止脱毛剂顺被毛到达毛根深郎损伤皮肤.用镊子夹棉球或纱布团蘸脱毛荆徐抹在已剪去被毛的部位,3~5min后用温水洗去脱下的毛和脱毛剂.

    脱毛的要求是不应损伤脱毛区的表皮,脱毛区面积不大于动物体裹面积的l0%。于脱毛后Z4h涂抹一定量受试物,盖上2~4层纱布和一层玻璃纸或塑料薄膜.再用无刺激性的胶布固定,接触规定的时间。如要求重复接触受试化学物,一般间隔l周再剪剃毛1次。

 
    (四)注射染毒

    注射用药品,应以注射途径染毒,对非啮齿类可模拟人拟用注射途径,而啮齿类的尾静脉和肌内注射难以多次染毒,必要时可改为皮下注射或腹腔注射。注射染毒,应调整受试物的pH及渗透压,pH应为5~8,最好是等渗溶液,动物对高渗的耐受力比低渗强。静脉注射应控制速度,大鼠尾静脉注射最好控制在10秒以上。腹腔注射在遗传毒理学实验中有时也用,但在致畸试验、肝UDS研究不应该用腹腔注射,为避免可能的损伤和局部高浓度对靶器官的影响。此外,在注射前应注意局部消毒;
 
 
    1.皮下注射(SC) 注射时以左手拇指和示指提起皮肤,将连有针头的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般犬、猫多在大腿外侧,豚鼠在大腿内侧或小腹部;大鼠可在下腹部。兔在背部或耳根部注射。
 
 
    2.皮内注射(ID) 皮内注射时需将注射的局部脱去被毛,消毒后.用左手拇指和食指按住皮肤并使之绷紧,在两指之间,用结核菌素注射器连细针头,紧贴皮肤表层刺入皮内,然后再向上挑起并再稍刺入,即可注射药液,此时可见皮肤表面蚊起一白色小皮丘。
 
 
    3.肌内注射(IM) 肌内注射应选肌肉发达,无大血管通过的部位,一般多选臀部。注射时垂直迅速刺入肌肉,回抽针栓如无回血,即可进行注射。给小鼠、大鼠等小动物作肌内注射时,用左手抓住鼠两耳和头部皮肤,右手取连有针头的注射器,将针头刺人大腿外侧肌肉,将药液注入。
 
 
    4.腹腔注射(IP) 大、小鼠腹腔注射时,以左手抓住动物,使腹部向上,右手将注射针头于左(或右)下腹部刺人皮下,使针头向前推约o.5cm,再以45度角穿过腹肌,固定针头,缓缓注入药液,为避免伤及内脏,可使动物处于头低位,使内脏移向上腹。着实验动物为家兔,进针部位为下腹部的腹自线旁开lcm处。
 
 
    5.静脉注射(IV)
 
 
    (1)小鼠和大鼠广般采用尾静脉注射,鼠尾静脉有3根,左右两侧及背侧各一根,左右两侧尾静脉比较容易固定,多采用。操作时先将动物固定在鼠筒内,使尾巴霹出,尾部用45℃~50℃的温水浸润半分钟或用酒精擦拭使血管扩张,并可使表皮角质软化,以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧,使静脉充盈,用中指从下面托起尾巴,以无名指和小指夹住尾巴的末梢,右手持注射器连号细针头,使针头与静脉平行(小于30度),从距尾尖2~3cm处进针,此处皮薄易于刺入,先抽回血,再缓注少量药液,如无阻力,表示针头已进入静脉,可继续注入。注射完毕后棉球压迫止血或把尾部向注射侧弯曲以止血.如需反复注射,应尽可能从末端开始,以后向尾根部方向移动注射。在毒物动力学研究中大鼠在麻醉后还可采用舌下静脉注射。
 
 
    (2)兔,兔耳部血管分布清晰,兔耳中央为动脉,耳外缘为静脉。内缘静脉深不易固定,故不用。外静脉表浅易固定,常用。先拔去注射部位的被毛,用手指弹动或轻揉兔耳,使静脉充盈,左手示指和中指夹住静脉的近端,拇指绷紧静脉的远端、无名指及小指垫在下面,右手持注射6S连6号针头尽量从静脉的远端刺人,移动拇指于针头上以固定针头,放开示指和中指,将药液注入,然后拔出针头,用手压迫针眼片刻。
 
 
    (3)犬;静脉注射用前肢内侧面皮下的头静脉、后肢胫部下1/3的外侧皮下的小隐静脉,可多次重复注射或静脉滴注。

 
    (五)染毒途径最大容积

    对于各种染毒途径的最大容积,以受试的实验动物物种或制剂来确定.一般推荐,染毒最大容积为:①经口20mi/kg(对空腹动物):②经皮2mi/kg(根据体表面积计算,限于染毒的准确性);③静脉lml/kg(5min以上);④肌内注射o.5mi/kg(一个部位);⑤每眼0.01ml;⑥直肠0.5ML/kg⑦阴道:大鼠0.2ml,兔lml;⑧吸人2mg/L;⑨鼻:猴或犬每鼻孔0.1m1。